Mhoileciuilich ginteil rannsachadh dòigh

Gus sgrùdadh a dhèanamh agus a 'comharrachadh Tionndaidhean ann an DNA structar a chleachdadh Mhoileciuilich ginteil dòigh. Airson gach DNA sgìre, a tha a 'rannsachadh an sgìre seo an chromosome, gine no allele, na dòighean eadar-dhealaichte. A tha air cùl gach modh Mhoileciuilich ginteil gabhail a-steach cuid no eile cloc RNA agus DNA. All na dòighean sin a tha air a chomharrachadh le mòr iom-fhillteachd, gun a h-obair-lann nach gabh a dhèanamh, agus an luchd-obrach a dh'fheumas a bhith barantaichte. Tha an obair seo a dhèanamh ann an grunn ìrean.

ìrean

Chiad, RNA no sampaill de DNA a dhèanamh. An seo, tha Mhoileciuilich ginteil dòigh ghabhas a chur ri cha mhòr stuth sam bith: boinne fala, leukocytes, fibroblasts cultar, mucosa (sgrìobadh), eadhon a 'ghruag follicles, - DNA gheibhear bho shampall sam bith. Tha e freagarrach airson an cleachdadh sam bith Mhoileciuilich ginteil dòighean agus an diofar roghainnean agus 's fhada iomallach DNA a stòradh reòite. Tha an dàrna ìre a choisrigeadh gu an cruinneachadh de miannaichte mìrean (leudachadh) de DNA, mar a tha e a 'cuideachadh le bhith a' dèanamh cinnteach polymerase sèine-bhualadh ann an vitro (ann vitro gun a bhith a 'fuireach bheairt). Mar thoradh air, a thaghadh DNA criomag iomadachadh le sreath seo bhualadh, agus air an uiread de DNA àrdachadh litireil milleanan de amannan.

Tha an treas ceum ann an Mhoileciuilich ginteil dòighean-obrach rannsachaidh a tha a 'bheachd lionmhor DNA bacadh (tha seo a briseadh, reubadh no gearradh). Cuingealachaidh a 'cluich le electrophoresis air polyacrylamide no agarose glaineid. Tha seo a 'Mhoileciuilich-ginteil dòigh a' dèanamh an DNA criomag h-uile duine a 'toirt cothrom a ghabhail air cuid a suidheachadh ann an glaineid. Às dèidh sin, an glaineid thathar a 'dèiligeadh le ethidium bromide, comasach air ceangaltach gu DNA, an irradiation ultraviolet le solus, agus an uair sin tha e comasach sùil luminescence cuibhrionnan. Mhoileciuilich ginteil breithneachaidh dòighean a tha eadar-dhealaichte agus lìonmhor, ach a 'chiad dà ceumannan a tha coitcheann do na h-uile. Ach ann an òrdugh a chomharrachadh DNA mìrean, an glaineid Faodar dathte, is mòran eile ann mar-thà dhòighean-obrach.

ghnèithean

Tha a 'chuid as motha de dhòighean dìreach agus farsaing airson lorgaireachd mycobacteria dòcha gabhail a-steach os cionn Mhoileciuilich ginteil DNA ionnsachaidh. Tha brìgh 'S e sin, gus an Leth-bhreac slabhraidh stuth sònraichte mìrean de DNA bhitheagan. Mhoileciuilich ginteil breithneachaidh dòighean-obrach nach eil fhathast air an dòigh nas èifeachdaiche a bhith ag aithneachadh leithid galaran mar chaitheamh. A 'cleachdadh na slabhraidh polymerase reaction (PCR), faodaidh tu bhith cinnteach gu bheil a' chiad DNA Meudaichidh an àireamh de lethbhric ann an millean turas, is e sin, nach bi leudachadh, agus bidh e a 'taisbeanadh nan toraidhean. Na cugallachd ìre glè àrd - còrr is ceithir fichead 'sa còig sa cheud, a tha am prìomh bhuannachd na dòigh seo.

Tha an còrr den Mhoileciuilich-ginteil dòighean rannsachaidh air èifeachdas toradh iomadh lethbhreac litireil a dhà uiread, bho sa chùis seo an dreachdadh sampall seo a 'sealltainn sònraichte oligonucleotide sreath meudachadh gu aon cheud agus sia tursan. Fiù 's a' chultar breithneachadh air a 'chaitheamh an siostam analach math nas ìsle a cugallach. 'S e seo carson a cungaidh-leigheis ùr-nodha a tha stèidhichte air Mhoileciuilich ginteil dòighean breithneachadh leis a' chaitheimh. A mhìneachadh dòigh èifeachdach gu h-àraidh nuair a bhios a 'dèiligeadh ri bhitheagan àrd antigenic chaochlaideachd, a' dearbhadh gu bheil dòigh eile ann a tha gu math nas duilghe - Feumaidh sònraichte beathachaidh meadhanan agus air àiteach ùine fhada. Biochemical agus Mhoileciuilich ginteil dòighean eadar-dhealaichte a 'dèanamh fìor bhuaidh a thoirt air na toraidhean.

breithneachadh air a 'chaitheamh

Marshall PCR breithneachadh air a 'chaitheamh as cumanta a bhith a' cleachdadh an fheadhainn DNA sreathan a tha sònraichte airson a h-uile ceithir seòrsachan a 'ghalair. Gus seo a choileanadh an amas tric a 'cleachdadh primers a lorg òrdugh THA eileamaidean (THA-986, THA-6110), mar eileamaidean seo a' comharrachadh fìor gnèithean imrich Mycobacterium leis a 'chaitheimh agus an-còmhnaidh an làthair ann an iomadh lethbhreac genome. Cuideachd DNA a tharraing a ghiùlain a-mach à fìor-ghlan agus cultaran Clionaigeach (sputum de dh'euslaintich) le freagarrach dòigh sam bith eile. Mar eisimpleir, chan Boom dòigh far a bheil an lysis bufair ga chleachdadh stèidhichte air an guanidine thiocyanate agus mar silica-giùlain DNA. Tha an àireamh de dh'euslaintich tha eadar-dhealaichte bochd bacteriological a 'meudachadh gach bliadhna, agus mar sin ann an cleachdadh clionaigeach air a stèidheachadh gu tur eadar-dhealaichte ìre na buidhne: Mhoileciuilich-ginteil dòigh a' sgrùdadh DNA air a bhith a 'cluich na prìomh phàirt ann an breithneachadh.

Ach, feumaidh sinn aideachadh nach eil e gun drawbacks. Tha PCR dòigh a tha a 'cleachdadh gu tric a' toirt àireamh mhòr de meallta-toraidhean deimhinneach, agus an t-adhbhar nach eil e a-mhàin teicnigeach mearachdan, ach cuideachd na feartan a tha air an dòigh fhèin. A thuilleadh air sin, a 'cleachdadh an dòigh seo a bhreithneachadh gus dearbhadh an ion-obrachadh mycobacteria, a chaidh a chomharrachadh, tha e dìreach do-dhèanta. Ach seo anacothrom nach eil e as cudromaiche. Mhoileciuilich ginteil dòighean PCR breithneachaidh gabhail a-steach an cunnart a thruailleadh mycobacterial DNA. Barrantachaidh riatanasan airson an adhbhar seo a-lannan airson PCR a dhealbhadh a-mhàin cruaidh, feum iad trì togalaichean fa leth. PCR Tha teicneòlas nuadh-aimsireil agus glè iom-fhillte, tha e ag iarraidh a 'cleachdadh uidheam iomchaidh agus àrd-luchd-obrach uidheamaichte.

bacterioscopy

Nuair a breithneachadh toraidhean a 'mion-sgrùdadh a dh'fheumas a bhith air an coimeas ri dàta eile: dheuchainnean clionaigeach, radiography,' smeuradh microscopy, bàrr agus fiù 'freagairt ri leigheas sònraichte a tha glè chudromach. Anns an t-sreath seo, a 'PCR Eòlais S e aon de na co-phàirtean. 'Fuasgladh an fhàs-bheairt ghalair tràth san breithneachadh a dh'fhaodas a bhith a' sìmplidhe agus as luaithe dòighean - bacteriological.

Tha a chleachdadh solas miocroscop (dathan Ziehl-Neelsen) agus stuth sruth (dathan fluorochromes). A 'bhuannachd a tha a' smeuradh astar na toraidhean. Ach rud a tha dhìth a tha gu ceart a 'beachdachadh air a' bheagan comas air sgàth ìosal cugallach. Ach, tha an dòigh seo air a thoirt seachad WHO a 'mholadh mar as saoire agus air an talamh gus an lorg chaitheamh euslaintich. Lorgaidh de mycobacteria bacteriological dòigh fàisneachd Tha luach agus meas quantitatively bacteriach excretion. Mòran nas misneachaile a 'dèiligeadh ris Mhoileciuilich ginteil dòighean-obrach rannsachaidh leis a' chaitheimh.

cultaran

Better lorgaidh de mycobacteria aithneachadh rannsachadh cultarach. Cur pathological stuth a tha e air dhèanamh a-steach an t-ugh tro mheadhan: Mordovsky, Finn II, LJ, agus an leithid. Comharran-measaidh 'cur an aghaidh na mycobacteria gu cungaidh-leigheis agus neo-dhìreach fianais air èifeachdas an àireamh de mycobacteria agus an colonaidhean ann an vitro, ma tha' cur an gnìomh dòigh-rannsachaidh a cultar. Meudachadh air an àireamh sa cheud de iomallachd mycobacteria inoculation pathological de stuth air a chumail air iomadh-àrainneachdan.

Coinneachadh feumalachdan iomadh cultarail, fhàs-bheairt ghalair gabhail a-steach tabhartas agus lionn. A chleachdadh ann an siostam seo agus fèin-ghluasadach mheidheadairean seòrsa VANTES fàs. Bàrr feumar an cumail ann altraim airson suas ri seachd no ochd seachdainean. Aig an àm seo a 'bhàrr le dìth fàs faodar beachdachadh àicheil. Tha an dòigh as èifeachdaiche gus lorg Mycobacterium 'chaitheamh a' beachdachadh air bith-eòlasach sampaill: breithneachaidh stuth infect Guinea mucan, a tha air leth buailteach do TB.

Nithean figearan

Interesting achadh sgrùdadh, a chaidh a fhosgladh le PCR breithneachaidh a bha a 'sgrùdadh M. chaitheamh - suain galar. Tha an latha an-diugh bun-bheachd TB galar a 'moladh a-mach à ceud dhaoine a bha ann an conaltradh le M. chaitheamh, ceithir fichead-dòcha gu bhith air a ghalar, ach a-mhàin deich dhiubh gnìomhach tinneas ga leasachadh. Tha feadhainn eile air TB dhìon, agus a chionn ceithir fichead sa cheud de na cùisean an galar fhathast falaichte. Fuasgladh pàtran a tha e air a chuidich e Mhoileciuilich ginteil dòigh.

Geneticists ag ràdh gu bheil leth-cheud 'sa còig sa cheud den fheadhainn aig a bheil bàrr pathological stuth bha àicheil, agus ceithir fichead às a' cheud de dhaoine galair le M. chaitheamh, ach a ta sruthadh le eil radiographic Foillsicheadh tinneas, PCR deagh freagairtean a fhuair iad. 'S e ginteil breithneachaidh dòigh chuidich a chomharrachadh euslaintich ann an cunnart le PCR-eòlas, leis na toraidhean aca-anailisean (microscopy agus cultar) a àicheil, agus subclinical M.' chaitheamh galar a bha an làthair.

nuadh-rannsachaidh

Tha Russian Federation agus bacteriological-lannan a 'cleachdadh grad dòigh iomlan dùmhlachdan: nitrate reductase gnìomhachd mycobacteria fheuchainn le Griess reagent. Anti-TB ionadan a 'cleachdadh modh-obrach a leigeas gus dearbhadh an aghaidh dhrugaichean. Tha seo a shìolachadh ann an leaghan meadhanan, far a bheil fèin-ghluasadach radiometric agus stuth sruth-siostam cunntasachd fàs mycobacteria. A leithid mion-sgrùdadh air a dhèanamh gu luath - suas gu dà sheachdain.

An-dràsta, dòighean ùra gan leasachadh: drogaichean an aghaidh na mycobacteria air a thomhas aig genotype ìre. Sgrùd na Mhoileciuilich uidheamachdan 'cur an aghaidh agus a' sealltainn ghinean an làthair ann an mycobacteria. Tha iad sin a ghinean a tha co-cheangailte ri cur an aghaidh cuid de dhrogaichean. Mar eisimpleir, kasA ghinean, inhA, katG resistant gu isoniazid, rpoB gine - rifampicin 16Sp RNA gineachan agus rpsL - streptomycin, emb1 - gus ethambutol, gyrA - a fluoroquinolone agus mar sin air.

mùthaidhean

Tha an latha an-diugh breithneachadh mòr nas motha na Mhoileciuilich-ginteil ìre dòigh airson DNA ag ionnsachadh agus a 'leigeil a dhèanamh air sgèile mhòr Eòlais na mùthaidhean ann an uile speactram. A-nis tha fios againn gu bheil na mùthaidhean as cumanta ann an 516, 526 agus 531 codons an rpoB gine, agus chomharraich an aghaidh diofar dhrogaichean. Tha raon iomlan de dhòighean-obrach airson a 'taipeadh de mycobacteria bhith a' cleachdadh a-mhàin Chan eil dòighean traidiseanta - biochemical, bith-eòlasach agus cultarail, ach cuideachd gan cleachdadh dòighean ùr-nodha Mhoileciuilich ginteil. Mar-thà a tha iomchaidh agus a 'toirt a' cheart dòigh airson breithneachadh an lorg monogenic galaran. Tha iad stèidhichte air DNA Eòlais anns an dearbh sgìre sònraichte gine. Tha seo mar as trice pròiseas toinnte, an ùine a 'caitheamh agus cosgail, ach tha an dàta a tha air a thoirt seachad le Mhoileciuilich ginteil mion-sgrùdadh, a tha mòran nas neo-mhearachdach agus fiosrachail na an dàta a h-uile mion-sgrùdaidhean eile.

Tha e air a dh'fhaid a bhith aithnichte gu bheil an DNA nach eil ag atharrachadh fad na beatha na fàs-bheairt a tha e ann an sam bith nucleated ceallan odnakova, agus tha seo ga dhèanamh comasach a 'gabhail a' mion-sgrùdadh dìreach a h-uile ceallan a 'chuirp, aig ìre sam bith de ontogeny. Tha mhilleadh gine Faodar lorg an làthair an coltas a 'chiad comharraidhean gus an làn-sgèile galar clionaigeach, a thuilleadh air ann an fallain heterozygous dhaoine, ach a bhith a' mutation ann an gine. Mhoileciuilich ginteil oighreachail tinneas breithneachaidh dòighean-obrach a 'leigeil a' nochdadh a (dìreach dòigh-obrach, DNA-breithneachaidh), cho math ri bhith a 'sgrùdadh an sgaraidh a' ghalair ann an teaghlach le comharradh loci DNA (ginteil polymorphisms), a tha gu dlùth ceangailte ri mhilleadh gine ( 'se sin, an neo-dhìreach dòigh-obrach de DNA-breithneachaidh). Dìreach no neo-dhìreach - DNA breithneachaidh sam bith a tha stèidhichte air na dòighean a chomharrachadh a teann air a mhìneachadh cuibhrionn an daonna DNA.

dìreach dòighean

Direct dòighean DNA breithneachadh nuair a tha an duine a gine oighreachail ghalair air an ainmeachadh, cho ainmeil, agus seòrsachan a mùthaidhean. Mar eisimpleir, dìreach dòighean freagarrach ann an àireamh de ghalaran. Tha seo a ' Huntington aig chorea (leudachan CTG--rithist), phenylketonuria (R408W), cystic fibrosis (delF508, prìomh-mùthaidhean) agus an leithid. Tha am prìomh bhuannachd na dòigh dìreach a tha fo làn-shealbh breithneachaidh mionaideachd, agus nach 'eil feum a dhèanamh DNA mion-sgrùdadh air a' chòrr dhen teaghlach. Ma mutation ann an co-fhreagarrach a lorg gine, tha cothrom dìreach aonta a chur ris a 'breithneachadh air heredity, genotype co-dhùnadh airson a' chòrr den teaghlach a eallach.

'Bhuannachd eile dìreach breithneachadh a tha air a chomharrachadh a heterozygous giùlain droch mùthaidhean bho a càirdean agus a pàrantan a bhàsaich bho ghalaran. Tha seo gu sònraichte fìor airson galaran autosomal recessive. Eas-bhuannachdan de dìreach dòighean cuideachd rim faotainn. Airson tagradh a chur orra, feumaidh tu fios dìreach an cruth ionadail neo-àbhaisteach gine, exon-intron structar a speactram agus a mùthaidhean. Neo-uile monogenic galaran-diugh a fhuair an leithid fiosrachaidh. Informativeness dìreach dòighean chan urrainn beachdachadh air iomlan, a chionn an aon gine dòcha gum bi àireamh mhòr de pathological mutation a tha ag adhbhrachadh leasachadh oighreachail galaran.

dòighean neo-dhìreach

Neo-dhìreach dòighean ann an DNA breithneachaidh air an cleachdadh aig na h-uile, ann an suidheachaidhean eile, ma tha a 'milleadh gine nach eil air ainmeachadh, ach a-mhàin chromosomally, no ma tha an loidhne breithneachadh cha tug thoradh (e a' tachairt, ma tha an gine iom-fhillte Mhoileciuilich buidhne no gu ìre mhòr, ma tha tòrr pathological mùthaidhean). Dòighean neo-dhìreach a 'cluich sgaraidh mion-sgrùdadh comharran polymorphic ann allelic teaghlach. Comharrachaidh a lorg anns an aon sgìre no chromosomal gnothach a tha ceangailte gu dlùth ri tinneas agus a 'riochdachadh deletions no insertions, puing substitutions, ath-chraoladh nuadh, agus an polymorphism tha ri diofar suim de na ceallan ann an loga bacaidh.

As goireasach airson breithneachadh neo-dhìreach beachdachadh microsatellite agus minisatellite polymorphisms, a tha air sgaoileadh ann an daonna genome. an luach aca a chur an cèill ann an àrd fiosrachadh susbaint, ma milleadh gu ginteil astar eadar na chomharra agus a 'ghine nach eil e ro mhòr. Sa chùis mu dheireadh, a 'mheas neo-mhearachdachd a dhearbhadh gu ìre mhòr air an tricead de recombination eadar an polymorphic chomharra agus a milleadh. Dòighean neo-dhìreach breithneachaidh cuideachd a 'toirt àithnteil tòiseachaidh ceum de allele tricead de na mion-sgrùdadh air sluagh sgrùdadh am measg euslaintich agus a' giùlan na mùthaidhean, plus eigin co-dhùnadh an coltachd de recombination de nonequilibrium adhesion agus luchd-comharrachaidh agus mutant alleles.

dòighean eile

Goirid earrannan den RNA no DNA, a thuilleadh air singilte gine ìomhaigh fo bhìodach sgrùdadh nach urrainn a bhith, mar sin, a chomharrachadh mùthaidhean a dhìth air Mhoileciuilich ginteil breithneachadh. Tha "Daonna Genome Pròiseact", a thuilleadh eile adhartasan ann an Mhoileciuilich gintinneachd air leudachadh gu mòr air comas na breithneachadh air oighreachail galaran - an dà chuid ro agus postnatal. Tha na dòighean urrainn toirt seachad tràth-lorgaidh agus a 'dèanamh fàisneachd agus poly- monogenic ghalaran, aig a bheil chiad gabhail àite ann an inbhich. Gu mì-fhortanach, air sgàth an comasan teicnigeach Mhoileciuilich ginteil Eòlais tha taobh a-muigh uaireannan na beusanta crìochan a tha air a shuidheachadh ann an co-cheangal ri oighreachd, gu h-àraidh nuair a tha breithneachadh ann òigeachd agus leanabachd.

Structarail agus àireamhach chromosomal abnormalities as cumanta adhbharan tinneas agus aillse, agus mòran malformations. Chromosomal aberrations dh'fheumas a bhith air a chomharrachadh, a tha cudromach airson comhairleachadh teaghlaich - gus measadh a dhèanamh air an aimsir, còmhla ri gintinn ann an cunnart san àm ri teachd torrachasan. Chromosome mion-sgrùdadh a tha "òr coitcheann" ginteil breithneachadh, ach tha e gann. Chan eil ach an dòighean Mhoileciuilich ginteil mion-sgrùdadh urrainn barrachd a dhèanamh, a chionn an sin a 'cleachdadh an teicneòlas cloning stèidhichte stuth sruth bileagan comasach air an cuid àrd mhothachaidh a chomharrachadh seòlta chromosomal-atharrachaidhean a tha do-dhèanta a lorg clasaigeach cytogenetic sgrùdaidhean. Na dòighean-obrach a 'sìor leudachadh ar breithneachaidh comasan, nuair a sgrùdadh, clann le ciorramachdan leasachaidh, inntinn retardation, le mòran eile oighreachail galaran.

toraidhean

Tha e fìor chudromach airson a 'chinne-daonna a bha' ghine structar is gnìomh eòlas, seòrsa chaochlaideachd, an comas a bhith a 'lorg oighreachail galaran a thachair ann an co-cheangal ri leasachadh Mhoileciuilich gintinneachd. dòighean a tha ag amas air an sgrùdadh air an DNA moileciuil sa chruinne-- agus nuair a tha e àbhaisteach, agus nuair a tha e air a mhilleadh. Ullachadh deoxyribonucleic acid sreathan de nucleotides (DNA) a 'leudachadh ann an ìre bho faighinn sampaill fa leth a chomharrachadh criomagan. Iomallach de genomic DNA bho cheallan, cuingeachadh (spìonadh le slàbhraidh), 'leudachadh (cloning), electrophoresis de na mìrean (sgaradh aca dealain asgaidh agus Mhoileciuilich cuideam le agarose glaineid). Comharrachadh sònraichte mìrean suidhichte air uachdar leth srian.

An uair sin a 'faighinn a-steach don Achd sònraichte criathragan, tro bhith a' dol gach criomag gintinn thar ghnèithean le cloned DNA mìrean no fuadain probes rèidio-beò a tha a smachd, a bhios co-ionnan ris gach deuchainn sampall. Ma dh'atharraicheas an suidheachadh no fad an coimeas ris an deuchainn, ma ùr criomag no dh'fhalbh - tha seo uile a 'moladh gum mion-sgrùdadh gine air a dhol tro ath-eagrachadh ann an nucleotide sreath. Tha ochd bunaiteach dòighean Mhoileciuilich ginteil Eòlais: òrdachaidh (diongmhaltas DNA òrdugh), polymerase slabhraidh reaction (meudachadh anns an àireamh de ruithean), deasachadh primers aithnichte ghinean, DNA cloning, riochdachaidh de recombinant molecules bunaichte pròtainean sgàth recombinant molecules, a 'cruthachadh seata iomlan (chruinneachadh leabharlainn) cloned mìrean a chaidh fhaighinn le bhith a 'cleachdadh an cuingeachadh.